articlewriting1

các phương pháp tạo biến dị di truyên – Tài liệu text

Giải bài tập

các phương pháp tạo biến dị di truyên

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (710.19 KB, 15 trang )

1. Phương pháp lai hữu tính
Chương 5
Phương pháp tạo biến dị di
truyền trong chọn giống cây trồng

• Sự giao phối có thể xảy ra trong tự nhiên (lai tự
nhiên) hoặc do con người tiến hành (lai nhân
tạo) đều tạo ra biến dị tái tổ hợp và có giá trị
trong chọn giống cây trồng.
• Khi bố mẹ khác nhau 2 cặp gen alen ở thế hệ F2
sẽ thu được 2 kiểu gen mới,
• nếu bố mẹ khác nhau 3 cặp gen alen ở thế hệ
F2 thu được 6 kiểu gen mới.
• Tổng quát khi lai hai bố mẹ khác nhau n gen
alen, sẽ có 2n giao tử và số kiểu gen là 3n.
• Quần thể nhỏ nhất ở F2 cần thiết để biểu hiện
các biến dị là 4n cá thể.

• Phương pháp lai hữu tính tạo giống thường
được ứng dụng đối với cây trồng có cấu tạo hoa
hoàn chỉnh.
• Đối với thực vật có cấu tạo hoa hoàn chỉnh gồm
đủ cả nhị và nhuỵ thì cần tiến hành khử đực
(emasculation) ở cây mẹ trước khi tiến hành lai.
• Các loài cây trồng có sinh sản đặc thù như: bất
dục đực (male sterility), đơn tính cái
(Gynoecious), tự bất hợp (self – incompatibility)
do yếu tố di truyền gene nhân, tế bào chất hay
do yếu tố môi trường có thể lợi dụng hiện tượng
này để giảm bớt công khử đực, hạt thu được
trên cây mẹ là hạt lai

• Khái niệm:
“Lai giống là sự giao phối (thụ phấn, thụ
tinh) giữa hai hay nhiều dạng bố mẹ có
nền di truyền khác nhau để tạo ra biến dị
tái tổ hợp theo mục tiêu chọn giống ”.

Ví dụ: Lai 2 bố mẹ khác nhau 3 cặp gen alen tạo
ra các kiểu gen mới như sau:
P1

AAbbCC x

aaBBcc

P2

F1

AaBbCc

F2

AABBCC

Kiểu gen mới

AABBcc

Kiểu gen mới

AAbbCC

Kiểu gen bố mẹ

AAbbcc

Kiểu gen mới

aaBBCC

Kiểu gen mới

aaBBcc

Kiểu gen bố mẹ

aabbCC

Kiểu gen mới

aabbcc

Kiểu gen mới

• Lai hữu tính tạo giống được phân chia thành
lai gần và lai xa:
– Lai gần là lai giữa hai bố mẹ trong cùng loài. Ví dụ, lai
giữa các giống trong mỗi loài lúa trồng Oryza sativa
L. (châu Á), O. glaberrima (châu Phi)…

– Lai xa là sự giao phối giữa hai bố mẹ khác loài hay
khác loài phụ. Ví dụ: lai hai bố mẹ thuộc hai loài phụ
lúa Indica x Japonica; lai giữa loài khoai tây trồng
(Solanum tuberosum L.) với loài khoai tây dại
(Solanum demissum) hay lai giữa chi (genus) lúa mỳ
(Triticum) với mạch đen (Secale) tạo ra cây Triticale.

1

5.1.2. Các phương pháp lai hữu tính
a) Lai đơn

(single cross): là lai một lần giữa hai bố

mẹ, phương pháp này ra đời sớm nhất, được
sử dụng rộng rãi và rất hiệu quả đến ngày nay
vì nó đơn giản, ít tốn kém, không yêu cầu
trang thiết bị và cơ sở vật chất lớn.
Công thức như sau:
AxB
Ký hiệu: A/B (theo IRRI và USDA)
hoặc A – B (theo CIMMYT).

c. Lai kép (double cross):
• Phương pháp lai giữa hai con lai F1 của
hai lai đơn, công thức lai:
(A x B) (C x D)
• Ký hiệu A/B//C/D (theo USDA);
A/B//C///D (theo IRRI);

A – B x C – D (theo CIMMYT).

Dòng 1
Dòng 2
Tester
Dòng 3
*
*
*

b) Lai ba (three-way cross)
• Phương pháp sử dụng con lai F1 của của
một lai đơn lai với một bố mẹ khác. Công
thức lai (A x B) x C
• Ký hiệu A/B//C (theo IRRI và USDA) hoặc
A – B x C (theo CIMMYT).

d. Lai đỉnh (topcross): thường được sử
dụng để xác định khả năng kết hợp chung
nhằm loại bỏ các dòng/giống không có
khả năng tổ hợp trong tạo giống ưu thế lai.
Các dòng/giống mang lai thử được lai với
vài ba giống ổn định về khả năng kết hợp
chung (thường là có khả năng kết hợp
chung thấp) và phổ di truyền rộng gọi là
tester (vật liệu thử). Kiểu lai này còn được
gọi là lai thử (line x tester).

e. Lai dialen (diallel cross): là kiểu lai giữa
một số dòng/giống nghiên cứu (thường từ

6-8 dòng/giống) mà mỗi mẫu giống được
lai lần lượt với các mẫu giống còn lại. Lai
luân giao dùng để xác định khả năng kết
hợp chung và khả năng kết hợp riêng của
các dòng/giống trong chọn giống ưu thế
lai.

Dòng n

Hình 5.1. Sơ đồ lai đỉnh

2

Griffing (1956) đưa ra 4 phương pháp lai như sau:
• Phương pháp 1: Lai thuận, lai nghịch và tự phối
(bố mẹ) và số tổ hợp lai = p2
• Phương pháp 2: Lai một chiều và tự phối (bố
mẹ) và số tổ hợp lai = p(p + 1)/2
• Phương pháp 3: Lai thuận, lai nghịch, không tự
phối và số tổ hợp lai = p(p – 1)
• Phương pháp 4: Lai một chiều không tự phối và
số tổ hợp lai = p(p – 1)/2

A

B

C

D

A

AxA

AxB

AxC

AxD

B

BxA

BxB

BxC

BxD

C

C xA

CxB

CxC

CxD

D

D xA

DxB

DxC

DxD

Hình 5.2. Sơ đồ lai dialen theo phương pháp 1 của Griffing

g. Lai thuận nghịch (reciprocal cross): là hai
cặp lai đơn mà vị trí bố mẹ được đổi cho nhau.
Lai thuận nghịch được sử dụng để xác định sự
khác nhau hay không về tế bào chất của hai bố
mẹ; khi có sự khác nhau về tính kết hạt của hai
cây bố mẹ có ưu thế lai F1 như nhau, lúc này
nên chọn cây có hạt nhiều làm mẹ.

A♀ x B♂
Lai thuận

B♀ x A♂
Lai nghịch

h. Lai lại (backcross) là lai giữa con lai (làm mẹ)
với một trong hai dạng bố mẹ. Kiểu lai này còn

được gọi là “lai tích luỹ”.
Lai lại được áp dụng chuyển gen mong muốn vào
một giống hay một dòng ưu tú như chuyển gen
kháng bệnh, lấy lại gen nhân của dòng bố
(mẹ) khi lai chuyển gen bất dục đực trong tạo
dòng bất dục đực CMS, giảm bớt gen không
mong muốn của một bố mẹ trong quá trình lai.

Hình 5.3. Lai thuận nghịch

h) Lai trở lại nhờ marker
(Marker-assisted backcrossing – MAB)
• Phương pháp MAB được tiến hành kết hợp giữa
phương pháp truyền thống (sử dụng phương
pháp lai lại) và phương pháp hiện đại (sử dụng
chọn lọc marker phân tử). Sau khi tiến hành lai
lại, ngay ở thế hệ đầu tiên (BC1F1), các cá thể
có kiểu gen mong muốn được chọn lọc thông
qua biểu hiện của các marker. Các cá thể này
có thể được sử dụng để lai lại cho các thế hệ
sau hoặc tự thụ tuỳ thuộc vào mục tiêu chọn
giống

3

c. Lai hồi quy: là kiểu lai giữa hai hay nhiều
cặp lai tích luỹ với nhau với mục đích bổ
sung nhiều đặc tính tốt cho con lai.

a. Lai nhiều bậc (convergent cross): là
kiểu lai giữa con lai đơn với một giống
có đặc tính mong muốn, con lai nhận
được tiếp tục lai với một giống khác có
đặc tính mới và cứ như thế có thể tiếp
tục lai với nhiều giống mà mỗi giống có
một ưu điểm riêng.

Beloturca x Potapca

Alpha x Xaroza

Albidum-24 x Liutexen55/11

Xaratopca-29
Hình 5.7. Sơ đồ lai tạo giống lúa mì Xaratopca-29 (A.P. Sekhudin)

d. Lai phức tạp: Lai giữa các con lai hay
thụ phấn hỗn hợp những hạt phấn của
một số dạng bố cho một giống mẹ.

k) Lai nhiều bố mẹ (multi-parent hybridization)
Phương pháp lai các cặp bố mẹ tạo các lai đơn và cuối
cùng lai các lai đơn với nhau.

Hình 5.8. Sơ đồ lai nhiều bố mẹ

4

TGST ngắn

g. Lai quy tụ gen dựa trên marker phân
tử (pyramiding)
Tương tự như phương pháp trên, lai quy tụ
gen cũng dựa trên marker phân tử ADN
liên kết với các gen mục tiêu sẽ giúp cho
việc chọn lọc được dễ dàng. Để tiến hành
được phương pháp này các nghiên cứu
cần tạo ra các dòng đẳng gen (NIL –
nearly isogenic line). Sau đó, các dòng
NIL này được tiến hành lai với nhau. Khi
chọn lọc sẽ sử dụng các marker liên kết
với các gen mong muốn để chọn lọc.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Năng suất cao
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112

Kháng rầy nâu và bạc lá
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112

Dòng/ giống mới quy tụ các gen quy định tính trạng mong muốn ở lúa
TGST ngắn – Habataki; Năng suất cao – Habataki; Kháng rầy nâu – ADR52; Kháng bạc lá – O. longistaminata

Phương pháp lai tế bào soma (Somatic
hybridization) được tiến hành lai ở mức độ tế bào

Các bước lai tế bào soma:
• Bước 1: Phân lập tế bào soma từ mô lá của
cây con, tinh sạch
– Cây bố mẹ được nuôi cấy in vitro tạo cây con trên
môi trường MS (Murashige và Skoog) có bổ sung
thêm các hóa chất khác phù hợp với yêu cầu nuôi
cấy của mỗi loài. Cây bố mẹ cũng có thể trồng trong
điều kiện nhà kính, nhà lưới hoặc trên đồng ruộng.
Mô lá của cây con sử dụng nuôi tạo calus để tách tế
bào trần (protoplast).

– Phân lập protoplast bằng các enzyme như
cellulase C1, xylanase, và pectin lyase, khi xử
lý các enzyme có thể gây tổn thương
protoplast cần có nghiên cứu để tránh tổn
thương như nghiên cứu của Shigetaka Ishii
(1988) phân lập protoplast tế bào lúa trong
môi trường bổ sung thêm AgNO3 đã tăng số
dòng nhân nhưng năng suất protoplast giảm.
Bổ sung thêm superoxide dismutase và
catalase cải thiện sự sống sót của protoplast
rõ rệt.

• Bước 2: Lai tế bào soma và kiểm tra tế bào
lai
– Dùng pipet hút tế bào trần (khoảng 150µl) đưa lên
miếng giấy nhỏ (cover slip) kích thước 22 x 22 mm,
đặt miếng giấy vào đĩa petri (60 x 15mm). Nhỏ một
giọt nhỏ silicone để giữ miếng giấy, sau 5 phút cố
định protoplast. Bổ sung 450µl dung dịch PEG (P2)

đưa vào nuôi cấy.
– Kiểm tra tế bào lai bằng phân tích isozyme, xác định
độ bội theo phương pháp của Grosser (1990), phân
tích marker phân tử RAPD sử dụng ADN tách chiết từ
các tế bào lai đã tái sinh, đồng thời với bố mẹ chọn
lọc các tế bào lai thành công.

• Bước 3: Tái sinh cây
Tách tế bào lai chuyển lên đĩa petri nuôi cấy
tạo calus, tạo rễ và tái sinh cây. Môi
trường điều kiện nuôi cấy tùy thuộc vào
loài cây trồng. Điều kiện nhiệt độ, ánh
sáng và độ ẩm môi trường nuôi cấy được
điều chính phù hợp.

5

Bước 4: Đánh giá và chọn lọc các thế hệ sau
lai tế bào soma
• Đánh giá và chọn lọc các thế hệ sau lai thực
hiện tương tự như lai hữu tính, đặc thù của lai tế
bào soma con cái các thế hệ sau lai có thể xảy
ra biến dị soma do nuôi cấy ngoài biến dị tái tổ
hợp do lai. Do vậy cần xác định nguồn biến dị
trong quá trình chọn lọc.
• Lai tế bào soma thường được sử dụng lai xa (lai
khác loài) do vậy con cái có thể xảy ra bất thụ,
trong quá trình chọn lọc áp dụng các biện pháp
khắc phục trở ngại con lai bất thụ như lai xa hữu

tính.

1.2 Lai xa

ng
u
t

• Do

u trong lai xa tăng
a
ng cây ng i c
u
n, sâu nh…

ng nh
n
i

ng
nh

c xa nhau
n
t di
n cho nên
p t
i,
i sau phân li

nh,
ng
c
t… nên
n c o
nh
ng
i c nh ng c
t
i.
i

n
i

• Nguyên lý chọn cặp bố mẹ (5)
• Gieo trồng, chăm sóc vườn cây bố mẹ
và chọn cây bố mẹ
• Chuẩn bị cây lai và dụng cụ lai
• Khử đực và bao cách li
• Thụ phấn và đánh dấu
• Chăm sóc và thu hoạch hạt lai

Những ứng dụng của lai xa

Lai xa là sự giao phối giữa các cá thể của hai loài trở lên.
Ví dụ: lai giữa loài khoai tây trồng (Solanum tuberosum
L.) với loài khoai tây dại (Solanum demissum) hay lai
giữa chi (genus) lúa mỳ (Triticum) với mạch đen
(Secale) tạo ra cây Triticale.

Kỹ thuật lai giống

Khó khăn khi lai xa
• Bất hợp lai, không tạo ra F1: do không hài hòa
trong hệ thống sinh lý của cây.
• F1 không có khả năng sống do bất dục NST,
Không hài hòa giữa nhân và tế bào chất giữa
các loài
• F1 bất dục: sự bất dục NST hay sự không hài
hòa của kiểu gen.
• Sự suy nhược của con lai: có trường hợp thu
được F1 có sức sống cao, hữu dục nhưng F2 lại
yếu và bất dục

• Chuyển gen mong muốn từ loài tổ tiên hoang
dại hoặc loài, chi có quan hệ họ hàng sang các
giống cây trồng, đặc biệt là các gen kháng sâu,
bệnh, bất dục, chống chịu…
• Tận dụng sức sống con lai ở những loài nhất
định
• Tạo ra các loài đa bội khác nguồn mới, như
triticale
• Xác định mối quan hệ tiến hóa giữa các loài.

Phương pháp khắc phục
a. Cản trở trước khi thụ tinh
– Chọn loài bố mẹ để lai
– Số tổ hợp lai: lai thử với số lượng lớn.

– Lai thuận nghịch
– Tăng mức bội thể
– Lai gián tiếp
– Cải tiến kỹ thuật lai: ghép phôi, hỗn hợp hạt
phấn, sử dụng dung môi hữu cơ, cắt bỏ đầu
nhụy trước khi thụ phấn, xử lý chất điều hòa
sinh trưởng, cắt ngắn vời ngụy, dung hợp tế bào
trần, thụ phấn in vitro…

6

Một số thành tựu lai xa

b. Cản trở sau khi thụ tinh:
– Sử dụng hormon sinh trưởng
phấn hỗn hợp
– Cứu phôi
– Ghép

c.

suy

c

F2

– Gieo ng i
n

n
i hi ng
ng
p gen
NST cân ng
– Lai i
u n i
i giao

o ra

• Cây lương thực
– Lúa: chuyển gen kháng c Xa21
i a i O. longistaminata, gen
virus…
i Triticale con lai
a
a
ch.
• Cây ăn quả
i Tangeto con lai
a
i C. x
paradisi i
t C. reticulata.

Ý nghĩa của đột biến

• Đột biến là cơ chế chủ yếu tạo ra biến dị di
truyền ở mọi cơ thể sống.
• Đột biến ở thực vật là những thay đổi di truyền
đột ngột xảy ra trong toàn bộ vật chất di truyền
(DNA) của cây.
• Đối với chọn tạo giống, đột biến cung cấp nguồn
vật liệu di truyền mang các tính trạng mới để
trực p hay gián tiếp tạo ra giống mới.

t phương
p
sung cho c phương
p
n
ng
c

c nhân

c nhân
n

gây ra

t

n

c(

c

ion

c
ion
i NST, t t

a
t

t
n

c
u

c nhân

ion
t
t
n
a

c

nh

t

a):
cao
m

thưa
m




a

t, phương
p t
c p ng khi:

c

2. Phương pháp đột biến

ng

n

n

n
nhiên không
nh ng
mong
n.
nh ng mong
n
trong cây ng nhưng
liên t
t i nh ng không mong
n.
t
ng ưu đang gieo ng n i n
t
nh ng đơn
n.
nh ng mong
n
trong cây i nhưng
lai
liên t
t i nh ng không
mong
n.
n
n
i cây sinh n ng con
ng
vô nh (cây nh, cây ăn
)

ng
ng o
nhau (Micke, 1990)

nh

c

c nhân

t

n

c

c nhân
ĐB

Cây ss
ng t

Cây ss sinh
ng

Tia gamma

366

204

570

Tia X

65

227

292

36

13

49

17

7

24

81

14

95

ng

ng

u gây ra
c

c m

Trung
c
c nhân

c
a

c

7

c

c
ion
trong

c

c

n

Tia gamma

ng

c

gây
Nguy

m

ng
ng
(60Co, 137Cs);
ng
t ch

0,1Ao

Nguy

m

n

n
2800-2900 Ao

c m

nguy
Neutron
(nhanh,
m,

.
t

n ng
ch

t

t

n

a

n

t

Tên

i

10-3 – 10nm

c m

c nhân

c thông

c

ng/
ng

y X quang

Tia X

Tia

a thông
t
n

Ethyl methane sulphonate

Không

ng

ng
ng

0,1 – 0,3%

u

N-methyl-N-nitrozo ure

C.

n,

u

ng

0,01 – 0,03%

N-ethyl-N-nitrozo ure

C.

n,

u

ng

0,01 – 0,03%

Natri azid (NaN3)

C.

n,

u

ng

0,001 – 0,004M

m

t nguy
m

ng

t)

u

.

ng

u
ng
:
u
ng
u (R) = năng
ng
t ra
n
c
Roentgen (R) =
erg/g t
t
u
ng p
(rad) = năng
ng
t ra
a
c
n sang i
ng
c
i
ng p
rad (r) =
erg/g t
t

u gây
t (LD50): u
ng
sau khi
%
cây ng t
năng ra hoa, t t.

• Phương
p:
c
ion a n
:
+
i gian
u
+
u
ng n
+
m
+
t
+
ng
oxy
Khi
t
n u
ng

p hơn
u so
i u
ng i ưu.
n
n, trong
ng u
ng
c
c
n ng ch
t
ng ch nhau
t
ng
i gian
t
nh

t

t

phương

u
u:

y

ng

n




cây: cây con,
t: t u ng
t
n
c
n sinh
nh sinh
ng
o trong nuôi

p

i cây
c nhau:

t
ng

n

c

i cây
n
ng:

t
nh giâm,

t,

y

c nhân a c:
ng
n ra ngâm
u trong dung
ch.
n
c
n c
n
p o
nghiêm
t.
+
c

c
ng n nh: m trương
t trong
c,
a
t, a ch,
phơi khô t.
+
c c nhân nh
ng:
ng
a
t,
t ,
pH,
i gian
( g),
ch dung ch ( p
n
ch t
c
)
+

8

. Quy
ng t
.

nh

n

c

n cây sinh sản

t

.

c

t

n

i nh

ng đơn gen

:
ng
t ng c nhân gây t
n;
c cây
M1

t
n
m;
n cây;
a
ng
hat/ bông a cây thu riêng; Đem gieo o
sau (M2).
: Gieo t a c cây
n theo ng; Quan t nh
;
n c
ch.
: Gieo c t
n M2
nh ng riêng M3;
i
ng ng không
t
n t
n; Thu hoach M3.
: So nh sơ
bao m
i
ng;
n
n
c ng ưu
so nh p i
u

m.
M5 – M8: p i c so nh
u a phương;
ng ng i t
c
ng
i.




. Quy nh
n vô nh

n

c

t

Quy
• B :

• B :
VM3;
ng VM2;

m
ng
nh ng
t di
n trong ng t
n.
p c phân p t
n soma
nhân cây t
n.
nh

c
t
n.
:
ng

t

p

c
t

a

nh
nh n
ng vô nh.

n

ng đa gen

i nh

• Công
c n nh gieo ng như
ng
p trên nhưng công c
n c
n
hơn y
c o
gen
m
t cho
nên
i gian
n
ng lâu hơn

n cây sinh

c
i t
n theo
t sinh mô a
nh sinh

ng bao m c ng sau:
m ng
n
m ng
m nh
t
t
n
n
n

• B –B

c

nh phân
t

• B :
m,

t

• B :
p

t

VM1;
n

p

t

n

n
m
i VM1,

t

n
p…

VM2; ng VM1; c nh
n; t
i không t

nh
n.

3.Ứng dụng đa bội thể và đơn
bội thể trong chọn giống

nh

9

. Đa
a

i

a đa

i

trong

ng sinh t trong
ng NST tăng theo
NST đơn i (
n

nhiên

n

o sinh
ng
i
nguyên
lên)
c i

t

ng

n a
đa

i

n
ng
n cây t n ( – %).
n n cây nuôi ng
i
i như a ,
a, khoai tây, khoai lang…

n ng
ng NST, c
t đa i
, ng vai
quan ng trong nh
nh
i.
nh n a a
i
nh
n
ng i sang đa i
• Trong n a, đa i

m
u gen
tăng
m năng i
p.

Quan

a
n

c

ng

t
a

đa i
nhiên
đa

Xi – xin

36 – 38

37,0

Hungari

44 – 49

48,6

Trung Âu

46 – 55

50,7

Đan

54 – 58

53,5

60 – 62

74,0

63 – 66

71,2

68

59,3

Spitsbergen

77 – 81

74,0

o Peary

82 – 84

85,9

ch

Tây nam Greenland
o băng
Tây

c Alaska

đa i
nh
p cao hơn
ng i nên
c ng
ưu
lai cao hơn.

c ng ng đa i
trong

n o
ng n n t n
do trong
u
ng p c
đa i nhân o
u
n
i
n
cân ng di
n.
• Trong
nhiên,
đa i
tương
quan i
cao.
c

trong
i

t
n
ng n hơn
u
m hơn.
• Sinh
ng

m hơn
t
c giai
n sinh
ng.

u c
p hơn
ng i, do
năng n
t t lai
khăn. Đa
ng cao
c
t c ng n.
• ng
n sinh
ng
m hơn cây
ng i.

c
. Đa

(%)

nh đa

i
i

i

ng

n (autopolyploid)

• Đa i
c i theo i
a
NST cơ
n (tam i – n;
i – 4n)

o
ng n hơn ng
i.

y hơn i
i/ ng
hơn.
ng xanh m
n hơn.

o
u
ng n hơn, trong
o o
a
ng p

u hơn

n đa

Di

ng
P

AA x aa

F1

Aa

n
i

AAAA x aaaa

o

0,5 A; 0,5a

nh

F1

0,167 AA; 0,667 Aa; 0,167 aa

phân ly
ng

ng

AAaa

Giao

i

i

i

F2

i
0,5A

0,5a

0,5A

0,25AA

0,25Aa

0,5a

0,25Aa

0,25aa

10

phân ly

F2

c

i
0,167AA

0,667Aa

0,167aa

0,167AA

0,0278
AAAA

0,1111
AAAa

0,0278
AAaa

0,667Aa

0,1111
AAAa

0,4444
AAaa

0,1111
Aaaa

0,167aa

0,0278
AAaa

0,1111
Aaaa

0.0278
aaaa

Phương

p

o đa

i

ng

ng

n

o đa i ng con
ng nguyên phân:
ng c c nhân ng, nh,
c gây mê…
c ng o
nh phân chia
m
m.

conchicine (C22H25NO6) hay
N2 O
u
n p
t cao
acenapthane.
c
t
y m
t
c năng a thoi vô c m cho
NST n phân chia nhưng

m c
không
c o
c, o
nh
o
i
NST tăng p đôi.
• Nuôi y mô

o đa i
ng con
ng
u nh hay
m
m

ng

u gen

F2

i

i

0,25 AA
0,50 Aa
0,25 aa

a o cơ
giao không
m
m 2n.

ng giao
y
ng NST
tương như trong
o soma.

n
giao
n
c
m
t di
n nhưng
nh
ng
nh i
n
i nh.

m

ng đa

0,0278 AAAA (Quadriplex)
0,2222 AAAa (Triplex)
0,5
AAaa (Duplex)
0,2222 Aaaa (Simplex)
0,0278 aaaa (Nulliplex)

i

ng

• Dưa u tam i không

i
ng tam i
• Nho
i
• Cây
c ăn gia c…

n trong

n

t

t

• Giao

u

n nh
nh thông qua
t
ng trong
nh
m
m
u do
nh sau:
m
m n
t không y .
u y o ra giao
n ng
t di
n
ng cây
.
m
m n
hai không y .
u y o
nh giao
n
c nhau

nhưng ng p .

11

nh đa
a

nh

Đa

i

c

n (allopolyploidy)

nh
nh do
tăng hay
u
NST
c nhau
gen a c
i hay c chi
c nhau)
c o
nh do lai

a c
i
c nhau i sau
NST
c nhân đôi.
c
gen
c nhau
ng
c
u ng
in
hoa (AABBDD…).
Đa i
c
n n i trong
nhiên
t cơ
o ra
i
i.
Đa i
c
n
u c cao hơn đa i
ng
n. Tuy nhiên,
u c
nh n nh a
đa i

nhân o
c o
c
tương ng
NST
a c
gen a c
i
.

P: 2n






ng đa

i

c

ng NST

b b

G

a

Tăng
i NST
a TB sinh
ng (1)

n

b

n

Tăng
i NST
a TB sinh
ng (1)

a b
(1)

ng nguyên

i

iA

a a a a
G

ng

do tăng
o sinh
ng

a a

(

i

a a

nguyên

i

a a b b

2n

x

ng nguyên

i

iB

b b b b
b b

2n

n

Tạo ra các loài cây trồng mới
Khắc phục cản trở khi lai xa
Phục hồi hữu dục ở con lai xa
Tăng khả năng kháng sâu bệnh và điều
kiện bất lợi.

Hình 5.17. Những con đường chủ yếu hình thành đa bội

3.3 Đơn bội thể

Tạo đơn bội thể

• Ý nghĩa:
– Sử dụng đơn bội thể có thể rút ngắn nhanh quá
trình đồng hợp tử hóa bằng cách chuyển từ đơn
bội sang đơn bội kép
– Cây đơn bội biểu hiện tất cả các thông tin di
truyền ra kiểu hình nên dễ dàng nhận biết các
alen lặn, khả năng kháng các điều kiện bất lợi…

– Có thể phát hiện đột biến ở cây đơn bội, những
đột biến không thể truyền qua giai đoạn phôi

• Các quá trình sau có thể dẫn đến tạo cây đơn
bội trong điều kiện in vivo
– Mẫu sinh (thụ tinh giả): tế bào đơn bội của túi
phôi phát triển thành bào tử thể.
– Phụ sinh: quá trình thụ tinh bình thường nhưng
tế bào trứng có nguồn gốc từ bộ gen cây mẹ bị
nhân bố đẩy ra ngoài và nhân bố gắn vào tế bào
chất mẹ rồi phát triển thành bào tử thể đơn bội
– Loại trừ NST: Loại trừ hoàn toàn bộ gen của 1
trong 2 bố mẹ ở con lai sẽ dẫn đến đơn bội

12

Phương pháp 1: Tạo đơn bội bằng nuôi
cấy bao phấn
• Tạo đơn bội thể trong điều kiện in vitro:
– Nuôi cấy bầu và noãn không thụ tinh.
– Nuôi cấy bao phấn, hạt phấn.

Các bước nuôi cấy bao phấn tạo cây đơn bội:
• Bước 1: Lựa chọn kiểu gen
• Bước 2: Trồng và chăm sóc cây cho phấn
• Bước 3: Chuẩn bị môi trường nuôi cấy
• Bước 4: Thu bao phấn, khử trùng, bảo quản
• Bước 5: Nuôi cấy tạo calus và tái sinh cây
• Bước 6: Chuyển cây ra giá thể, ngoài đất và

đánh giá chọn lọc dòng.

Phương pháp nuôi cấy bao phấn
chú ý

Phương pháp 2: tạo đơn bội bằng
kích tạo đơn bội tự nhiên

• Khử trùng bao phấn non rồi đưa vào môi
trường nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp
(280C).
• Nhiều yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy bao
phấn như: điều kiện xử lý mẫu, môi
trường nuôi cấy, kiểu gen của vật liệu…

• Phương pháp kích tạo đơn bội tự nhiên hay còn
gọi là phương pháp tạo đơn bội kép (DH) in
vivo. Geiger (2009) trong cuốn sách chọn tạo
giống ngô (Nhà xuất bản Springer, New York)
đã thông báo rằng nếu thụ phấn các cây ngô có
kiểu gen đặc thù gọi là cây kích tạo (inducer),
cây nhận phấn tạo ra một tỉ lệ hạt nhất định có
phôi đơn bội (haploid embryo) và nội nhũ tam
bội. Kỹ thuật sử dụng rộng rãi phát triển dòng
thuần trong tạo giống ngô lai thương mại.

* Lưỡng bội hóa cây đơn bội tạo cây đơn bội kép
(DH):
Phương pháp lưỡng bội hóa cây đơn bội từ nuôi
cấy bao phấn hay kích tạo đơn bội (in vivo) phổ

biến nhất là sử dụng colchicine (Gayen và cs.,
1994; Deimling và cs., 1997; Eder và Chalyk,
2002). Chất alkaloid này hoạt động cản trở quá
trình phân chia tế bào và dẫn đến không giảm
số lượng nhiễm sắc thể khi phân chia.
Colchicine có tính độc cao, ngày nay có thể sử
dụng một số chất khác thay thế là thuốc trừ cỏ,
pronamid, APM, trifluralin, oryzalin, Nitrous oxide
gas (Kato, 2002), nhưng những chất thay thế
này không phù hợp xử lý một số lượng lớn.
Hình 5.20. Các bước tạo dòng DH ở ngô băng Phương pháp in vivo
(Nguồn Andrés Gordillo và cs., 2010)

13

4 Tạo biến dị bằng công nghệ tế bào
4.1 Nguồn gốc của các biến dị tế bào soma
a. Những thay đổi di truyền xảy ra trước khi nuôi cấy
mô in vitro:
Trong quá trình phát triển cá thể, phân hoá và già hoá
của mô và tế bào một số các thay đổi di truyền đã xảy
ra và được tích luỹ trong các tế bào soma (D’amato,
1985). Nhờ kỹ thuật nuôi cấy mô, cây được tái sinh từ
tế bào soma sẽ là các đột biến. Các nhà khoa học
đưa ra khái niệm automutagenesis – tự đột biến (đột
biến xảy ra không do các tác nhân từ bên ngoài gây
nên hay là đột biến tự nó – automuctagenesis).

4.2 Các hướng ứng dụng của hiện tượng biến dị tế bào

sôma
Như đã phân tích ở trên, việc gây tạo và chọn lọc các đột
biến tế bào soma xảy ra trong nuôi cấy in vitro có nhiều
ứng dụng đa dạng:
– Tạo ra dòng tế bào nuôi cấy có khả năng sản xuất các
chất hoạt tính sinh học với năng suất cao (xem công
nghệ bioreactor)
– Tạo ra các giống cây trồng mang những đặc tính biến dị
quý, ví dụ, các nhà khoa học ở Đài Loan đã chọn tạo
được giống chuối thấp cây, chống chịu bệnh thối rũ do
nấm Fusarium gây ra. ở nước ta, Viện Công nghệ sinh
học đã tạo được giống lúa mới DR2 có khả năng chịu
hạn, chịu lạnh bằng phương pháp chọn lọc các biến dị tế
bào soma in vitro từ một giống lúa không có khả năng
chống chịu. Giống này đã được công nhận là giống quốc
gia.

5.1. Các phương pháp chuyển gen
5.1.1 Chuyển gen trực tiếp
Là phương pháp chuyển trực tiếp các gen đã
được thiết kế trong plasmid vào tế bào thực vật
có sự trợ giúp của yếu tố hoá học, vật lý và tác
nhân cơ giới. Chuyển gen trực tiếp thông qua
một số kỹ thuật sau
a. Chuyển gen bằng xung điện
b. Chuyển gen nhờ xử lý PEG (polyethylene
glycon)
c. Chuyển gen bằng vi tiêm
d. Chuyển gen bằng súng bắn gen

b. Những thay đổi di truyền xảy ra trong quá
trình in vitro:
Một nguồn biến dị tế bào soma quan trọng là thay
đổi trong bộ máy di truyền xảy ra khi nuôi cấy
tạo mô sẹo và phân hoá cơ quan in vitro.
Chroqui và Bercetch (1985) cho biết auxin gây ra
đa bội hoá bên trong tế bào nuôi cấy
(endopolyploidization).
Oono (1982) nuôi cấy mô sẹo từ hạt lúa và tái sinh
cây từ mô sẹo cho biết BAP có nồng độ 30 mg/l
tạo ra tần số đột biến lớn gấp 50 lần so với BAP
ở nồng độ 2 mg/l.

5. Tạo biến dị bằng công nghệ gen
(chuyển gen)
• Chuyển gen là một công cụ mới bổ sung
cho chọn tạo giống truyền thống và có thể
giúp cho việc mở rộng các nguồn gen có
lợi từ các loài khác chuyển sang các loài
cây trồng mong muốn. Công nghệ chuyển
gen có lợi thế là có thể chuyển một gen
đơn hoặc gen số lượng mà phương pháp
truyền thống rất khó thực hiện.

5.1.2 Chuyển gen gián tiếp
Phương pháp chuyển gen gián tiếp là gen
được chuyển vào tế bào thực vật qua
một sinh vật trung gian, thường là vi sinh
vật hoặc virus.
a. Chuyển gen nhờ virus

b. Chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens

14

Phương pháp chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens
• Cơ sở của phương pháp này dựa trên hiện tượng nhóm
vi khuẩn Agrobacterium mang plasmid gây khối u ở thực
vật gọi là Ti-plasmid như mô tả trong hình

• Bước 6: bên trong tế bào chất của tế bào ký chủ
T-DNA tồn tại một chút T-complex thành thục,
phân tử T-strand có độ dài hoàn chỉnh với vỏ là
một số phân tử VirE2. Những phân tử này là TDNA cấu trúc và protein cần thiết cho vận
chuyển nhân đến nhân tế bào ký chủ, đây là
bước chính trong quá trình biến nạp di truyền;
• Bước 7: thâm nhập vào nhân;
• Bước 8: vận chuyển trong nhân;
• Bước 9: T- DNA không vỏ bọc;
• Bước 10: hòa hợp với di truyền ký chủ.

Cơ chế quá trình vi khuẩn chuyển
gen vào tế bào
• Bước 1: vi khuẩn tiếp xúc với thực vật;
• Bước 2 và 3: kích thích sự biểu hiện của vùng
vir bằng tín hiệu đặc thù của ký chủ;
• Bước 4: tạo phân tử ADN sợi đơn (T- strand), tổ
hợp hoạt động của protein VirD1 và VirD2;

• Bước 5: tế bào vi khuẩn tồn tại T-DNA như một
phức hợp protein ADN với một phân tử VirD2
gắn ở đầu 5’ của T-strand và có một số protein
vir khác chuyển vào tế bào ký chủ bằng hệ
thống VirB/D4, mỗi bước yêu cầu có tương tác
của T-pilus với 1 protein đặc thù của ký chủ;

Các bước chuyển gen nhờ vi khuẩn
• Bước 1: Tách và nhân vi khuẩn
• Bước 2: Gắn ADN cần chuyển vào Ti plamid của vi khuẩn
• Bước 3: Tách mô chuyển gen
• Bước 4: Lây nhiễm vi khuẩn đã gắn
plamid vào mô tế bào
• Bước 5: Tái sinh cây chuyển gen
• Bước 6: Đánh giá cây chuyển gen

15

• Khái niệm : “ Lai giống là sự giao phối ( thụ phấn, thụtinh ) giữa hai hay nhiều dạng cha mẹ cónền di truyền khác nhau để tạo ra biến dịtái tổng hợp theo tiềm năng chọn giống ”. Ví dụ : Lai 2 cha mẹ khác nhau 3 cặp gen alen tạora những kiểu gen mới như sau : P1AAbbCC xaaBBccP2F1AaBbCcF2AABBCCKiểu gen mớiAABBccKiểu gen mớiAAbbCCKiểu gen bố mẹAAbbccKiểu gen mớiaaBBCCKiểu gen mớiaaBBccKiểu gen bố mẹaabbCCKiểu gen mớiaabbccKiểu gen mới • Lai hữu tính tạo giống được phân loại thànhlai gần và lai xa : – Lai gần là lai giữa hai cha mẹ trong cùng loài. Ví dụ, laigiữa những giống trong mỗi loài lúa trồng Oryza sativaL. ( châu Á ), O. glaberrima ( châu Phi ) … – Lai xa là sự giao phối giữa hai cha mẹ khác loài haykhác loài phụ. Ví dụ : lai hai cha mẹ thuộc hai loài phụlúa Indica x Japonica ; lai giữa loài khoai tây trồng ( Solanum tuberosum L. ) với loài khoai tây dại ( Solanum demissum ) hay lai giữa chi ( genus ) lúa mỳ ( Triticum ) với mạch đen ( Secale ) tạo ra cây Triticale. 5.1.2. Các chiêu thức lai hữu tínha ) Lai đơn ( single cross ) : là lai một lần giữa hai bốmẹ, chiêu thức này sinh ra sớm nhất, đượcsử dụng thoáng đãng và rất hiệu suất cao đến ngày nayvì nó đơn thuần, ít tốn kém, không yêu cầutrang thiết bị và cơ sở vật chất lớn. Công thức như sau : AxBKý hiệu : A / B ( theo IRRI và USDA ) hoặc A – B ( theo CIMMYT ). c. Lai kép ( double cross ) : • Phương pháp lai giữa hai con lai F1 củahai lai đơn, công thức lai : ( A x B ) ( C x D ) • Ký hiệu A / B / / C / D ( theo USDA ) ; A / B / / C / / / D ( theo IRRI ) ; A – B x C – D ( theo CIMMYT ). Dòng 1D òng 2T esterDòng 3 b ) Lai ba ( three-way cross ) • Phương pháp sử dụng con lai F1 của củamột lai đơn lai với một cha mẹ khác. Côngthức lai ( A x B ) x C • Ký hiệu A / B / / C ( theo IRRI và USDA ) hoặcA – B x C ( theo CIMMYT ). d. Lai đỉnh ( topcross ) : thường được sửdụng để xác lập năng lực phối hợp chungnhằm vô hiệu những dòng / giống không cókhả năng tổng hợp trong tạo giống lợi thế lai. Các dòng / giống mang lai thử được lai vớivài ba giống không thay đổi về năng lực kết hợpchung ( thường là có năng lực kết hợpchung thấp ) và phổ di truyền rộng gọi làtester ( vật tư thử ). Kiểu lai này còn đượcgọi là lai thử ( line x tester ). e. Lai dialen ( diallel cross ) : là kiểu lai giữamột số dòng / giống điều tra và nghiên cứu ( thường từ6-8 dòng / giống ) mà mỗi mẫu giống đượclai lần lượt với những mẫu giống còn lại. Lailuân giao dùng để xác lập năng lực kếthợp chung và năng lực tích hợp riêng củacác dòng / giống trong chọn giống ưu thếlai. Dòng nHình 5.1. Sơ đồ lai đỉnhGriffing ( 1956 ) đưa ra 4 chiêu thức lai như sau : • Phương pháp 1 : Lai thuận, lai nghịch và tự phối ( cha mẹ ) và số tổng hợp lai = p2 • Phương pháp 2 : Lai một chiều và tự phối ( bốmẹ ) và số tổng hợp lai = p ( p + 1 ) / 2 • Phương pháp 3 : Lai thuận, lai nghịch, không tựphối và số tổng hợp lai = p ( p – 1 ) • Phương pháp 4 : Lai một chiều không tự phối vàsố tổng hợp lai = p ( p – 1 ) / 2A xAAxBAxCAxDBxABxBBxCBxDC xACxBCxCCxDD xADxBDxCDxDHình 5.2. Sơ đồ lai dialen theo chiêu thức 1 của Griffingg. Lai thuận nghịch ( reciprocal cross ) : là haicặp lai đơn mà vị trí cha mẹ được đổi cho nhau. Lai thuận nghịch được sử dụng để xác lập sựkhác nhau hay không về tế bào chất của hai bốmẹ ; khi có sự khác nhau về tính kết hạt của haicây cha mẹ có lợi thế lai F1 như nhau, lúc nàynên chọn cây có hạt nhiều làm mẹ. A ♀ x B ♂ Lai thuậnB ♀ x A ♂ Lai nghịchh. Lai lại ( backcross ) là lai giữa con lai ( làm mẹ ) với một trong hai dạng cha mẹ. Kiểu lai này cònđược gọi là “ lai tích luỹ ”. Lai lại được vận dụng chuyển gen mong ước vàomột giống hay một dòng xuất sắc ưu tú như chuyển genkháng bệnh, lấy lại gen nhân của dòng bố ( mẹ ) khi lai chuyển gen bất dục đực trong tạodòng bất dục đực CMS, giảm bớt gen khôngmong muốn của một cha mẹ trong quy trình lai. Hình 5.3. Lai thuận nghịchh ) Lai trở lại nhờ marker ( Marker-assisted backcrossing – MAB ) • Phương pháp MAB được triển khai tích hợp giữaphương pháp truyền thống lịch sử ( sử dụng phươngpháp lai lại ) và giải pháp tân tiến ( sử dụngchọn lọc marker phân tử ). Sau khi thực thi lailại, ngay ở thế hệ tiên phong ( BC1F1 ), những cá thểcó kiểu gen mong ước được tinh lọc thôngqua biểu lộ của những marker. Các thành viên nàycó thể được sử dụng để lai lại cho những thế hệsau hoặc tự thụ tuỳ thuộc vào tiềm năng chọngiốngc. Lai hồi quy : là kiểu lai giữa hai hay nhiềucặp lai tích luỹ với nhau với mục tiêu bổsung nhiều đặc tính tốt cho con lai. a. Lai nhiều bậc ( convergent cross ) : làkiểu lai giữa con lai đơn với một giốngcó đặc tính mong ước, con lai nhậnđược liên tục lai với một giống khác cóđặc tính mới và cứ như thế hoàn toàn có thể tiếptục lai với nhiều giống mà mỗi giống cómột ưu điểm riêng. Beloturca x PotapcaAlpha x XarozaAlbidum-24 x Liutexen55 / 11X aratopca – 29H ình 5.7. Sơ đồ lai tạo giống lúa mì Xaratopca-29 ( A.P. Sekhudin ) d. Lai phức tạp : Lai giữa những con lai haythụ phấn hỗn hợp những hạt phấn củamột số dạng bố cho một giống mẹ. k ) Lai nhiều cha mẹ ( multi-parent hybridization ) Phương pháp lai những cặp cha mẹ tạo những lai đơn và cuốicùng lai những lai đơn với nhau. Hình 5.8. Sơ đồ lai nhiều bố mẹTGST ngắng. Lai quy tụ gen dựa trên marker phântử ( pyramiding ) Tương tự như chiêu thức trên, lai quy tụgen cũng dựa trên marker phân tử ADNliên kết với những gen tiềm năng sẽ giúp choviệc tinh lọc được thuận tiện. Để tiến hànhđược giải pháp này những nghiên cứucần tạo ra những dòng đẳng gen ( NIL – nearly isogenic line ). Sau đó, những dòngNIL này được triển khai lai với nhau. Khichọn lọc sẽ sử dụng những marker liên kếtvới những gen mong ước để tinh lọc. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12N ăng suất cao1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112K háng rầy nâu và bạc lá1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 121 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112D òng / giống mới quy tụ những gen pháp luật tính trạng mong ước ở lúaTGST ngắn – Habataki ; Năng suất cao – Habataki ; Kháng rầy nâu – ADR52 ; Kháng bạc lá – O. longistaminataPhương pháp lai tế bào soma ( Somatichybridization ) được triển khai lai ở mức độ tế bàoCác bước lai tế bào soma : • Bước 1 : Phân lập tế bào soma từ mô lá củacây con, tinh sạch – Cây bố mẹ được nuôi cấy in vitro tạo cây con trênmôi trường MS ( Murashige và Skoog ) có bổ sungthêm những hóa chất khác tương thích với nhu yếu nuôicấy của mỗi loài. Cây bố mẹ cũng hoàn toàn có thể trồng trongđiều kiện nhà kính, nhà lưới hoặc trên đồng ruộng. Mô lá của cây con sử dụng nuôi tạo calus để tách tếbào trần ( protoplast ). – Phân lập protoplast bằng những enzyme nhưcellulase C1, xylanase, và pectin lyase, khi xửlý những enzyme hoàn toàn có thể gây tổn thươngprotoplast cần có nghiên cứu và điều tra để tránh tổnthương như nghiên cứu và điều tra của Shigetaka Ishii ( 1988 ) phân lập protoplast tế bào lúa trongmôi trường bổ trợ thêm AgNO3 đã tăng sốdòng nhân nhưng hiệu suất protoplast giảm. Bổ sung thêm superoxide dismutase vàcatalase cải thiện sự sống sót của protoplastrõ rệt. • Bước 2 : Lai tế bào soma và kiểm tra tế bàolai – Dùng pipet hút tế bào trần ( khoảng chừng 150 µl ) đưa lênmiếng giấy nhỏ ( cover slip ) kích cỡ 22 x 22 mm, đặt miếng giấy vào đĩa petri ( 60 x 15 mm ). Nhỏ mộtgiọt nhỏ silicone để giữ miếng giấy, sau 5 phút cốđịnh protoplast. Bổ sung 450 µl dung dịch PEG ( P2 ) đưa vào nuôi cấy. – Kiểm tra tế bào lai bằng nghiên cứu và phân tích isozyme, xác địnhđộ bội theo chiêu thức của Grosser ( 1990 ), phântích marker phân tử RAPD sử dụng ADN tách chiết từcác tế bào lai đã tái sinh, đồng thời với cha mẹ chọnlọc những tế bào lai thành công xuất sắc. • Bước 3 : Tái sinh câyTách tế bào lai chuyển lên đĩa petri nuôi cấytạo calus, tạo rễ và tái sinh cây. Môitrường điều kiện kèm theo nuôi cấy tùy thuộc vàoloài cây xanh. Điều kiện nhiệt độ, ánhsáng và nhiệt độ môi trường tự nhiên nuôi cấy đượcđiều chính tương thích. Bước 4 : Đánh giá và tinh lọc những thế hệ saulai tế bào soma • Đánh giá và tinh lọc những thế hệ sau lai thựchiện tựa như như lai hữu tính, đặc trưng của lai tếbào soma con cháu những thế hệ sau lai hoàn toàn có thể xảyra biến dị soma do nuôi cấy ngoài biến dị tái tổhợp do lai. Do vậy cần xác lập nguồn biến dịtrong quy trình tinh lọc. • Lai tế bào soma thường được sử dụng lai xa ( laikhác loài ) do vậy con cháu hoàn toàn có thể xảy ra bất thụ, trong quy trình tinh lọc vận dụng những biện phápkhắc phục trở ngại con lai bất thụ như lai xa hữutính. 1.2 Lai xang • Dou trong lai xa tăngng cây ng i cn, sâu nh … ng nhngnhc xa nhaut din cho nênp ti, i sau phân linh, ngt … nênn c onhngi c nh ng ci. • Nguyên lý chọn cặp cha mẹ ( 5 ) • Gieo trồng, chăm nom vườn cây bố mẹvà chọn cây bố mẹ • Chuẩn bị cây lai và dụng cụ lai • Khử đực và bao cách li • Thụ phấn và lưu lại • Chăm sóc và thu hoạch hạt laiNhững ứng dụng của lai xaLai xa là sự giao phối giữa những thành viên của hai loài trở lên. Ví dụ : lai giữa loài khoai tây trồng ( Solanum tuberosumL. ) với loài khoai tây dại ( Solanum demissum ) hay laigiữa chi ( genus ) lúa mỳ ( Triticum ) với mạch đen ( Secale ) tạo ra cây Triticale. Kỹ thuật lai giốngKhó khăn khi lai xa • Bất hợp lai, không tạo ra F1 : do không hài hòatrong mạng lưới hệ thống sinh lý của cây. • F1 không có năng lực sống do bất dục NST, Không hài hòa giữa nhân và tế bào chất giữacác loài • F1 bất dục : sự bất dục NST hay sự không hàihòa của kiểu gen. • Sự suy nhược của con lai : có trường hợp thuđược F1 có sức sống cao, hữu dục nhưng F2 lạiyếu và bất dục • Chuyển gen mong ước từ loài tổ tiên hoangdại hoặc loài, chi có quan hệ họ hàng sang cácgiống cây cối, đặc biệt quan trọng là những gen kháng sâu, bệnh, bất dục, chống chịu … • Tận dụng sức sống con lai ở những loài nhấtđịnh • Tạo ra những loài đa bội khác nguồn mới, nhưtriticale • Xác định mối quan hệ tiến hóa giữa những loài. Phương pháp khắc phụca. Cản trở trước khi thụ tinh – Chọn loài cha mẹ để lai – Số tổng hợp lai : lai thử với số lượng lớn. – Lai thuận nghịch – Tăng mức bội thể – Lai gián tiếp – Cải tiến kỹ thuật lai : ghép phôi, hỗn hợp hạtphấn, sử dụng dung môi hữu cơ, cắt bỏ đầunhụy trước khi thụ phấn, giải quyết và xử lý chất điều hòasinh trưởng, cắt ngắn vời ngụy, dung hợp tế bàotrần, thụ phấn in vitro … Một số thành tựu lai xab. Cản trở sau khi thụ tinh : – Sử dụng hormon sinh trưởngphấn hỗn hợp – Cứu phôi – Ghépc. suyF2 – Gieo ng ii hi ngngp genNST cân ng – Lai iu n ii giaoo ra • Cây lương thực – Lúa : chuyển gen kháng c Xa21i a i O. longistaminata, genvirus … i Triticale con laich. • Cây ăn quải Tangeto con laii C. xparadisi it C. reticulata. Ý nghĩa của đột biến • Đột biến là chính sách đa phần tạo ra biến dị ditruyền ở mọi khung hình sống. • Đột biến ở thực vật là những đổi khác di truyềnđột ngột xảy ra trong hàng loạt vật chất di truyền ( DNA ) của cây. • Đối với chọn tạo giống, đột biến cung ứng nguồnvật liệu di truyền mang những tính trạng mới đểtrực p hay gián tiếp tạo ra giống mới. t phươngsung cho c phươngngc nhânc nhângây rac ( ionioni NST, t tc nhânionnha ) : caothưat, phươngp tc p ng khi : 2. Phương pháp đột biếnngnhiên khôngnh ngmongn.nh ng mongtrong cây ng nhưngliên tt i nh ng không mongn.ng ưu đang gieo ng n i nnh ng đơnn. nh ng mongtrong cây i nhưnglailiên tt i nh ng khôngmongn. i cây sinh n ng conngvô nh ( cây nh, cây ănngng onhau ( Micke, 1990 ) nhc nhânc nhânĐBCây ssng tCây ss sinhngTia gamma366204570Tia X652272923613491724811495ngngu gây rac mTrungc nhâniontrongTia gammanggâyNguyngng ( 60C o, 137C s ) ; ngt ch0, 1A oNguy2800 – 2900 Aoc mnguyNeutron ( nhanh, m, n ngchTên10-3 – 10 nmc mc nhânc thôngng / ngy X quangTia XTiaa thôngEthyl methane sulphonateKhôngngngng0, 1 – 0,3 % N-methyl-N-nitrozo ureC. n, ng0, 01 – 0,03 % N-ethyl-N-nitrozo ureC. n, ng0, 01 – 0,03 % Natri azid ( NaN3 ) C.n, ng0, 001 – 0,004 Mt nguyngt ) ngngngu ( R ) = năngngt raRoentgen ( R ) = erg / g tng p ( rad ) = năngngt ran sang ingng prad ( r ) = erg / g tu gâyt ( LD50 ) : ungsau khicây ng tnăng ra hoa, t t. • Phươngp : ion a ni gianng nngoxyKhin ungp hơnu soi ung i ưu. n, trongng ungn ng chng ch nhaungi giannhphươngu : ngcây : cây con, t : t u ngn sinhnh sinhngo trong nuôii câyc nhau : ngi câyng : nh giâm, t, c nhân a c : ngn ra ngâmu trong dungch. n cp onghiêmt. ng n nh : m trươngt trongc, t, a ch, phơi khô t. c c nhân nhng : ngt, t, pH, i gian ( g ), ch dung ch ( pch t. Quyng tnhn cây sinh sảni nhng đơn genngt ng c nhân gây tn ; c câyM1m ; n cây ; nghat / bông a cây thu riêng ; Đem gieo osau ( M2 ). : Gieo t a c câyn theo ng ; Quan t nhn cch. : Gieo c tn M2nh ng riêng M3 ; ng ng khôngn tn ; Thu hoach M3. : So nh sơbao mng ; c ng ưuso nh p im. M5 – M8 : p i c so nhu a phương ; ng ng i tngi .. Quy nhn vô nhQuy • B : • B : VM3 ; ng VM2 ; ngnh ngt din trong ng tn. p c phân p tn somanhân cây tn. nhsơn. ngnhnh nng vô nh.ng đa geni nh • Côngc n nh gieo ng nhưngp trên nhưng công cn chơn yc ogent chonêni gianng lâu hơnn cây sinhi tn theot sinh mô anh sinhng bao m c ng sau : m ngm ngm nh • B – Bnh phân • B : m, • B : VM1 ; i VM1, p … VM2 ; ng VM1 ; c nhn ; ti không tnhn. 3. Ứng dụng đa bội thể và đơnbội thể trong chọn giốngnh. Đaa đatrongng sinh t trongng NST tăng theoNST đơn i ( nhiêno sinhngnguyênlên ) c ingn ađangn cây t n ( – % ). n n cây nuôi ngi như a, a, khoai tây, khoai lang … n ngng NST, ct đa i, ng vaiquan ng trong nhnhi.nh n a anhng i sang đa i • Trong n a, đa iu gentăngm năng ip. Quanngđa inhiênđaXi – xin36 – 3837,0 Hungari44 – 4948,6 Trung Âu46 – 5550,7 Đan54 – 5853,560 – 6274,063 – 6671,26859,3 Spitsbergen77 – 8174,0 o Peary82 – 8485,9 chTây nam Greenlando băngTâyc Alaskađa inhp cao hơnng i nênc ngưulai cao hơn. c ng ng đa itrongn ong n n t ndo trongng p cđa i nhân ocân ng din. • Trongnhiên, đa itươngquan icao.trongng n hơnm hơn. • Sinhngm hơnc giain sinhng. u cp hơnng i, donăng nt t laikhăn. Đang caot c ng n. • ngn sinhngm hơn câyng i .. Đa ( % ) nh đangn ( autopolyploid ) • Đa ic i theo iNST cơn ( tam i – n ; i – 4 n ) ng n hơn ngi. y hơn ii / nghơn. ng xanh mn hơn. ng n hơn, trongo ong pu hơnn đaDingAA x aaF1AaAAAA x aaaa0, 5 A ; 0,5 anhF10, 167 AA ; 0,667 Aa ; 0,167 aaphân lyngngAAaaGiaoF20, 5A0, 5 a0, 5A0, 25AA0, 25A a0, 5 a0, 25A a0, 25 aa10phân lyF20, 167AA0, 667A a0, 167 aa0, 167AA0, 0278AAAA0, 1111AAA a0, 0278AA aa0, 667A a0, 1111AAA a0, 4444AA aa0, 1111A aaa0, 167 aa0, 0278AA aa0, 1111A aaa0. 0278 aaaaPhươngo đangngo đa i ng conng nguyên phân : ng c c nhân ng, nh, c gây mê … c ng onh phân chiam.conchicine ( C22H25NO6 ) hayN2 On pt caoacenapthane. y mc năng a thoi vô c m choNST n phân loại nhưngm ckhôngc oc, onhNST tăng p đôi. • Nuôi y môo đa ing conngu nh hayngu genF20, 25 AA0, 50 Aa0, 25 aaa o cơgiao khôngm 2n.ng giaong NSTtương như trongo soma.giaot din nhưngnhngnh ii nh.ng đa0, 0278 AAAA ( Quadriplex ) 0,2222 AAAa ( Triplex ) 0,5 AAaa ( Duplex ) 0,2222 Aaaa ( Simplex ) 0,0278 aaaa ( Nulliplex ) ng • Dưa u tam i khôngng tam i • Nho • Câyc ăn gia c … n trong • Giaon nhnh thông quang trongnhu donh sau : m nt không y. u y o ra giaon ngt ding câym nhai không y. u y onh giaoc nhaunhưng ng p. 11 nh đanhĐan ( allopolyploidy ) nhnh dotăng hayNSTc nhaugen a ci hay c chic nhau ) c onh do laia cc nhau i sauNSTc nhân đôi. genc nhaungu nginhoa ( AABBDD … ). Đa in n i trongnhiênt cơo rai. Đa iu c cao hơn đa ingn. Tuy nhiên, u cnh n nh ađa inhân oc otương ngNSTa cgen a cP : 2 nng đang NSTb bTăngi NSTa TB sinhng ( 1 ) Tăngi NSTa TB sinhng ( 1 ) a b ( 1 ) ng nguyêniAa a a angdo tăngo sinhnga aa anguyêna a b b2nng nguyêniBb b b bb b2nTạo ra những loài cây xanh mớiKhắc phục cản trở khi lai xaPhục hồi hữu dục ở con lai xaTăng năng lực kháng sâu bệnh và điềukiện bất lợi. Hình 5.17. Những con đường đa phần hình thành đa bội3. 3 Đơn bội thểTạo đơn bội thể • Ý nghĩa : – Sử dụng đơn bội thể hoàn toàn có thể rút ngắn nhanh quátrình đồng hợp tử hóa bằng cách chuyển từ đơnbội sang đơn bội kép – Cây đơn bội bộc lộ toàn bộ những thông tin ditruyền ra kiểu hình nên thuận tiện phân biệt cácalen lặn, năng lực kháng những điều kiện kèm theo bất lợi … – Có thể phát hiện đột biến ở cây đơn bội, nhữngđột biến không hề truyền qua tiến trình phôi • Các quy trình sau hoàn toàn có thể dẫn đến tạo cây đơnbội trong điều kiện kèm theo in vivo – Mẫu sinh ( thụ tinh giả ) : tế bào đơn bội của túiphôi tăng trưởng thành bào tử thể. – Phụ sinh : quy trình thụ tinh thông thường nhưngtế bào trứng có nguồn gốc từ bộ gen cây mẹ bịnhân bố đẩy ra ngoài và nhân bố gắn vào tế bàochất mẹ rồi tăng trưởng thành bào tử thể đơn bội – Loại trừ NST : Loại trừ hoàn toàn bộ gen của 1 trong 2 cha mẹ ở con lai sẽ dẫn đến đơn bội12Phương pháp 1 : Tạo đơn bội bằng nuôicấy bao phấn • Tạo đơn bội thể trong điều kiện kèm theo in vitro : – Nuôi cấy bầu và noãn không thụ tinh. – Nuôi cấy bao phấn, hạt phấn. Các bước nuôi cấy bao phấn tạo cây đơn bội : • Bước 1 : Lựa chọn kiểu gen • Bước 2 : Trồng và chăm nom cây cho phấn • Bước 3 : Chuẩn bị môi trường tự nhiên nuôi cấy • Bước 4 : Thu bao phấn, khử trùng, dữ gìn và bảo vệ • Bước 5 : Nuôi cấy tạo calus và tái sinh cây • Bước 6 : Chuyển cây ra giá thể, ngoài đất vàđánh giá tinh lọc dòng. Phương pháp nuôi cấy bao phấnchú ýPhương pháp 2 : tạo đơn bội bằngkích tạo đơn bội tự nhiên • Khử trùng bao phấn non rồi đưa vào môitrường nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp ( 280C ). • Nhiều yếu tố tác động ảnh hưởng đến nuôi cấy baophấn như : điều kiện kèm theo giải quyết và xử lý mẫu, môitrường nuôi cấy, kiểu gen của vật tư … • Phương pháp kích tạo đơn bội tự nhiên hay còngọi là giải pháp tạo đơn bội kép ( DH ) invivo. Geiger ( 2009 ) trong cuốn sách chọn tạogiống ngô ( Nhà xuất bản Springer, Thành Phố New York ) đã thông tin rằng nếu thụ phấn những cây ngô cókiểu gen đặc trưng gọi là cây kích tạo ( inducer ), cây nhận phấn tạo ra một tỉ lệ hạt nhất định cóphôi đơn bội ( haploid embryo ) và nội nhũ tambội. Kỹ thuật sử dụng thoáng đãng tăng trưởng dòngthuần trong tạo giống ngô lai thương mại. * Lưỡng bội hóa cây đơn bội tạo cây đơn bội kép ( DH ) : Phương pháp lưỡng bội hóa cây đơn bội từ nuôicấy bao phấn hay kích tạo đơn bội ( in vivo ) phổbiến nhất là sử dụng colchicine ( Gayen và cs., 1994 ; Deimling và cs., 1997 ; Eder và Chalyk, 2002 ). Chất alkaloid này hoạt động giải trí cản trở quátrình phân loại tế bào và dẫn đến không giảmsố lượng nhiễm sắc thể khi phân loại. Colchicine có tính độc cao, thời nay hoàn toàn có thể sửdụng một số ít chất khác sửa chữa thay thế là thuốc trừ cỏ, pronamid, APM, trifluralin, oryzalin, Nitrous oxidegas ( Kato, 2002 ), nhưng những chất thay thếnày không tương thích giải quyết và xử lý một số lượng lớn. Hình 5.20. Các bước tạo dòng DH ở ngô băng Phương pháp in vivo ( Nguồn Andrés Gordillo và cs., 2010 ) 134 Tạo biến dị bằng công nghệ tế bào4. 1 Nguồn gốc của những biến dị tế bào somaa. Những đổi khác di truyền xảy ra trước khi nuôi cấymô in vitro : Trong quy trình tăng trưởng thành viên, phân hoá và già hoácủa mô và tế bào 1 số ít những đổi khác di truyền đã xảyra và được tích luỹ trong những tế bào soma ( D’amato, 1985 ). Nhờ kỹ thuật nuôi cấy mô, cây được tái sinh từtế bào soma sẽ là những đột biến. Các nhà khoa họcđưa ra khái niệm automutagenesis – tự đột biến ( độtbiến xảy ra không do những tác nhân từ bên ngoài gâynên hay là đột biến tự nó – automuctagenesis ). 4.2 Các hướng ứng dụng của hiện tượng kỳ lạ biến dị tế bàosômaNhư đã nghiên cứu và phân tích ở trên, việc gây tạo và tinh lọc những độtbiến tế bào soma xảy ra trong nuôi cấy in vitro có nhiềuứng dụng phong phú : – Tạo ra dòng tế bào nuôi cấy có năng lực sản xuất cácchất hoạt tính sinh học với hiệu suất cao ( xem côngnghệ bioreactor ) – Tạo ra những giống cây cối mang những đặc tính biến dịquý, ví dụ, những nhà khoa học ở Đài Loan đã chọn tạođược giống chuối thấp cây, chống chịu bệnh thối rũ donấm Fusarium gây ra. ở nước ta, Viện Công nghệ sinhhọc đã tạo được giống lúa mới DR2 có năng lực chịuhạn, chịu lạnh bằng chiêu thức tinh lọc những biến dị tếbào soma in vitro từ một giống lúa không có khả năngchống chịu. Giống này đã được công nhận là giống quốcgia. 5.1. Các giải pháp chuyển gen5. 1.1 Chuyển gen trực tiếpLà chiêu thức chuyển trực tiếp những gen đãđược phong cách thiết kế trong plasmid vào tế bào thực vậtcó sự trợ giúp của yếu tố hoá học, vật lý và tácnhân cơ giới. Chuyển gen trực tiếp thông quamột số kỹ thuật saua. Chuyển gen bằng xung điệnb. Chuyển gen nhờ giải quyết và xử lý PEG ( polyethyleneglycon ) c. Chuyển gen bằng vi tiêmd. Chuyển gen bằng súng bắn genb. Những đổi khác di truyền xảy ra trong quátrình in vitro : Một nguồn biến dị tế bào soma quan trọng là thayđổi trong cỗ máy di truyền xảy ra khi nuôi cấytạo mô sẹo và phân hoá cơ quan in vitro. Chroqui và Bercetch ( 1985 ) cho biết auxin gây rađa bội hoá bên trong tế bào nuôi cấy ( endopolyploidization ). Oono ( 1982 ) nuôi cấy mô sẹo từ hạt lúa và tái sinhcây từ mô sẹo cho biết BAP có nồng độ 30 mg / ltạo ra tần số đột biến lớn gấp 50 lần so với BAPở nồng độ 2 mg / l. 5. Tạo biến dị bằng công nghệ tiên tiến gen ( chuyển gen ) • Chuyển gen là một công cụ mới bổ sungcho chọn tạo giống truyền thống lịch sử và có thểgiúp cho việc lan rộng ra những nguồn gen cólợi từ những loài khác chuyển sang những loàicây trồng mong ước. Công nghệ chuyểngen có lợi thế là hoàn toàn có thể chuyển một genđơn hoặc gen số lượng mà phương pháptruyền thống rất khó triển khai. 5.1.2 Chuyển gen gián tiếpPhương pháp chuyển gen gián tiếp là genđược chuyển vào tế bào thực vật quamột sinh vật trung gian, thường là vi sinhvật hoặc virus. a. Chuyển gen nhờ virusb. Chuyển gen gián tiếp trải qua vi khuẩnAgrobacterium tumefaciens14Phương pháp chuyển gen gián tiếp trải qua vi khuẩnAgrobacterium tumefaciens • Cơ sở của giải pháp này dựa trên hiện tượng kỳ lạ nhómvi khuẩn Agrobacterium mang plasmid gây khối u ở thựcvật gọi là Ti-plasmid như miêu tả trong hình • Bước 6 : bên trong tế bào chất của tế bào ký chủT-DNA sống sót một chút ít T-complex thành thục, phân tử T-strand có độ dài hoàn hảo với vỏ làmột số phân tử VirE2. Những phân tử này là TDNA cấu trúc và protein thiết yếu cho vậnchuyển nhân đến nhân tế bào ký chủ, đây làbước chính trong quy trình biến nạp di truyền ; • Bước 7 : xâm nhập vào nhân ; • Bước 8 : luân chuyển trong nhân ; • Bước 9 : T – DNA không vỏ bọc ; • Bước 10 : hòa hợp với di truyền ký chủ. Cơ chế quy trình vi trùng chuyểngen vào tế bào • Bước 1 : vi trùng tiếp xúc với thực vật ; • Bước 2 và 3 : kích thích sự biểu lộ của vùngvir bằng tín hiệu đặc trưng của ký chủ ; • Bước 4 : tạo phân tử ADN sợi đơn ( T – strand ), tổhợp hoạt động giải trí của protein VirD1 và VirD2 ; • Bước 5 : tế bào vi trùng sống sót T-DNA như mộtphức hợp protein ADN với một phân tử VirD2gắn ở đầu 5 ’ của T-strand và có 1 số ít proteinvir khác chuyển vào tế bào ký chủ bằng hệthống VirB / D4, mỗi bước nhu yếu có tương táccủa T-pilus với 1 protein đặc trưng của ký chủ ; Các bước chuyển gen nhờ vi trùng • Bước 1 : Tách và nhân vi trùng • Bước 2 : Gắn ADN cần chuyển vào Ti plamid của vi trùng • Bước 3 : Tách mô chuyển gen • Bước 4 : Lây nhiễm vi trùng đã gắnplamid vào mô tế bào • Bước 5 : Tái sinh cây chuyển gen • Bước 6 : Đánh giá cây chuyển gen15